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Religiert

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Religiert

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Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein.

Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. Biontechnology 5, , bei Guerrero et al. Applied and Environmental Microbiology 60, , bei LaBarre et al.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eines der vorstehend beschriebenen Proteine durch Einbringen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein entsprechendes Protein in den Mikroorganismus.

Das Einbringen der Nukleinsäure kann chromsomal oder extrachromosomal erfolgen, also durch Erhöhung der Kopienzahl auf dem Chromosom und oder eine Kopie des Gens auf einem sich replizierenden Plasmid in dem Wirtsmikroorganismus.

Vorzugsweise erfolgt das Einbringen der Nukleinsäure, beispielsweise in Form einer Expressionskassete, enthaltend die Nukleinsäure, chromosomal, insbesondere durch die vorstehend beschriebene SacB-Methode.

Dazu kann prinzipiell jedes Gen, das eines der vorstehend beschriebenen Proteine kodiert verwendet werden.

Bei genomischen Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall das der Wirtsmikroorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Proteine zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Vorzugsweise erfolgt die Reduzierung der vorstehend beschriebenen Aktivitäten in Mikroorganismen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren: Einbringen mindestens einer sense-Ribonukleinsäuresequenz zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette Einbringen mindestens eines DNA- oder Protein-bindenden Faktors gegen das entsprechede -Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette Einbringen mindestens einer den RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsverlustes, wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Verschiebungen im Leseraster, an einem Gen beispielsweise durch Erzeugung einer Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem Gen.

Bevorzugt können Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in das gewünschte Zielgen durch homologe Rekombination oder Einbringen von sequenzspezifischen Nukleasen gegen das Zielgen generiert werden.

Einbringen eines Promotors mit reduzierter Promotoraktivität oder einer Expressionseinheit mit reduzierter Expressionsaktivität. Dem Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Reduzierung seiner Aktivität oder Funktion eingesetzt werden können.

Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen Variante eines Proteins oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette vorteilhaft sein.

Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen.

Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z.

Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten.

Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Schwefelquelle für die Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden.

Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden.

Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch " Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" Hrsg.

Rhodes, P. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.

Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z.

Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z.

Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat.

Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis Stunden erreicht. Die so erhaltenen Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.

Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden.

Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden.

Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Die biosynthetischen Produkte können in unterschiedlichen Formen anfallen, beispielsweise in Form ihrer Salze oder Ester. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Bd.

Chromosomale DNA aus C. Das amplifizierte Fragment wird an seinem 5'-Ende von einem Sall Restriktionsschnitt und an seinem 3'-Ende von einem Mlul Restriktionsschnitt flankiert.

Das Plasmid wurden isoliert und durch Sequenzierung die erwartete Nukleotidsequenz bestätigt. Wort und Unwort des Jahres in Liechtenstein. Wort und Unwort des Jahres in Österreich.

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In der vorliegenden Erfindung ist es zum ersten Mal gelungen, Konjugate der Gyrase-hemmenden Aminocoumarin-Antibiotika und Catechol-Struktureinheiten herzustellen.

Durch die gezielte aktive Aufnahme der Substanzen in die bakterielle Zelle mittels Siderophor-Transporter wird ein neuer Aufnahmemechanismus in die Zelle bereitgestellt und die Gyrase-hemmenden Eigenschaften können effektiver genutzt werden.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der unten beschriebenen Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben.

In den Zeichnungen zeigen:. Um einen alternativen bzw. Die Catechol-Struktur des neuen Derivates wird von E. Nach der Herstellung bei der DNA2.

Durch Inaktivierung des Gens cloQ bleibt die Bildung von Ring A aus [18]; dies gewährleistet, dass einzig das neue Derivat mit Catechol-Struktur und nicht das natürliche Clorobiocin gebildet wird.

Das aus E. Eine Herstellung durch Mutasynthese, wie bereits für Aminocoumarin-Antibiotika beschrieben [21, 22], ist für die Herstellung catecholierter Verbindungen nicht möglich, da gefütterte Catechole schnell im Medium oxidiert oder als Kohlenstoffquelle metabolisiert werden [23].

Aus diesem Grund wurde eine kontinuierliche in vivo Biosynthese der Catecholsäuren bereitgestellt, um sie konstant der Aminocoumarin Biosynthese zur Verfügung zu stellen.

Eine Zusammenfassung des Herstellungsprozesses von Novclobiocin ist in dargestellt. Die Pre-Kultivierung von S.

Für die Extraktion wurden insgesamt 2 l Kultur auf pH 4,0 mit Salzsäure eingestellt und zweimal mit dem gleichen Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt.

Die organische Phase wurde bis zur Trockenheit einrotiert und der Rückstand in Methanol aufgenommen. Novclobiocin eluiert bei ca.

Die UV-Detektion wurde bei nm durchgeführt. Die Elektrospray Ionisation wurde im Negativ-Modus vollzogen.

Novclobiocin wurde in vitro unter Verwendung des Gyrase Supercoiling-Assay auf seine inhibitorische Aktivität auf E.

Dies beweist, dass die Ersetzung des natürlichen Ring A mit 3,4-Dihydroxybenzoesäure die Aktivität der Verbindung als Gyrase-Inhibitor nicht herabsetzt bzw.

Wie eben beschrieben hemmt Novclobiocin mit der gleichen Konzentration wie Clorobiocin die Gyrase von E. Ein Unterschied in der antibakteriellen Aktivität dieser beiden Verbindungen kann demnach an einem verstärktem Influx oder einem verringertem Efflux liegen.

Die Expression dieser Proteine wird unter Eisen-Mangel-Bedingungen aktiviert, wie sie auch im menschlichen Körper während einer bakteriellen Infektion vorherrschen [27].

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Heinrich Heine oder Milan Machovec waren davon betroffen. Auch Theodor Lessing drohte mehrfach die Relegation, da er sich gegen die autoritären Strukturen des Schulsystems auflehnte.

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